Description

La crioconservación es una técnica de conservación in vitro a largo plazo que permite almacenar germoplasma vegetal a temperaturas ultra bajas, preferentemente en Nitrógeno líquido (NL). Antes de crioconservar un material, es necesario caracterizarlo genéticamente y para ello se evaluaron con marcadores moleculares ISSR, vitroplantas de diferentes especies de vainilla (Vanilla insignis, V. odorata y V. planifolia), distintas accesiones (Vp., Vp. 6, 12, 13 y 20) pertenecientes a V. planifolia y el impacto del país de procedencia (México, Costa Rica y El Salvador) en la diversidad genética, respectivamente. Se extrajo ADN mediante el método modificado CTAB y se realizó la amplificación utilizando los cebadores T06, UBC 809, 840, 836 y 825. Los resultados demostraron que V. insignis y V. odorata poseen características genéticas más cercanas comparadas con V. planifolia. Los genotipos Vp. 13 y 20 presentaron mayor similitud, mientras que Vp. 12 podría no pertenecer a esta especie. Se encontraron bajos niveles de diversidad genética, siendo las de Costa Rica y El Salvador las más cercanas. Para los estudios criogénicos se compararon tres técnicas: Gota-Vitrificación (G-V), VCriolámina y D-Criolámina. Se utilizaron como modelo ápices de Vanilla planifolia, los cuales se preacondicionaron por un día en medio de cultivo MS semisólido con trehalosa 0.15M. Acorde G-V, los tejidos preacondicionados se expusieron 30 min a la solución de carga sacarosa o trehalosa (0.4M) con glicerol 2M, se deshidrataron 30 min con soluciones PVS (PVS2 o PVS3) y en gotas de PVS colocadas sobre láminas de aluminio, se sumergieron en NL. Con los métodos V y D-Criolámina, los ápices preacondicionados se gelificaron con alginato de calcio sobre las crioláminas, se trataron con las soluciones de carga y se deshidrataron con las PVS o por desecación (30, 60, 90, 120, 150 y 180 min) en campana de flujo laminar, respectivamente. Sólo D-Criolámina permitió la regeneración (33%), empleando la carga sacarosa-glicerol y 180 min de secado (contenido de humedad 17%). La recuperación post-crioconservación ocurrió por organogénesis indirecta y se verificó mediante análisis histológico. Múltiples brotes se lograron con el traspaso del callo a medio de cultivo con Kinetina (2mgL-1) y la exposición al fotoperiodo.